CRISPR两大先驱合作，揭示单碱基编辑易脱靶的原因
来源：学术经纬
2012年，被喻为“上帝的手术刀”的CRISPR-Cas9系统横空出世，短短的八年里，这种工具已经应用到包括医药、农业、基础科研等诸多领域。以经典的CRISPR-Cas9为基础，科学家们还开发出一系列工具，例如可以转换单个核苷酸的碱基编辑器，以期治疗单基因点突变导致的遗传疾病。然而，这些先进的新技术并非完美，其可能的脱靶效应及潜在的安全隐患同样十分引人关注。
日前，基因编辑领域的两位宗师级科学家JenniferDoudna教授和刘如谦(DavidLiu)教授联手，在《科学》杂志上报道了一种碱基编辑器的首个详细3D结构。“这一结构帮助我们从更深层次上理解碱基编辑器，”加州大学伯克利分校的Doudna教授说，“我们现在可以看清它是怎么工作的，就可以制定明智的策略来改良这个系统。”
Doudna教授与合作者在2012年发现，细菌中找到的CRISPR能用于基因组编辑。本质上看，CRISPR-Cas9是蛋白质和RNA的混合体，它们能够精确地瞄准一段特定的DNA，然后像剪刀一样剪开这段序列。
此后，哈佛大学和麻省理工学院Broad研究所的刘如谦教授等人开发出了首款碱基编辑器，将经过修饰的Cas9(禁用了其DNA剪接功能)与另一种细菌蛋白(脱氨酶)结合，无需使DNA断裂，就能定点修改基因中的单个碱基。这种碱基编辑器可以把DNA双链上的腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)组合替换为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)组合。在人类遗传疾病中，大约60%(超过15000种)的致病单碱基变异有望利用现有的碱基编辑器来纠正。
研究人员在论文中指出，早期的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)效率很低，但经过多次筛选，最新的版本ABE8e速度提高了约1100倍，能在15分钟内完成几乎100%的碱基编辑工作。
但除了效率提升外，要将碱基编辑器应用到人类遗传疾病的治疗上，科学家们还迫切想要解决“脱靶效应”，也就是针对无关DNA片段的编辑。
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蛋白质结构一直和其功能有密切的联系。因此，科学家希望通过解析蛋白质结构，找出与Cas9融合的蛋白为何会产生脱靶效应，以及如何优化。“作为一个结构生物学家，我真的想看清一个分子并思考如何合理地改进它。”共同第一作者GavinKnott博士说道。
在最新的这篇《科学》论文中，研究人员利用冷冻电镜技术(cryoEM)，以3.2埃的分辨率解析了ABE8e结合DNA时的3D结构。
“虽然碱基编辑器现在被广泛应用于生物体，从细菌到植物再到灵长动物，进行精确修饰，但目前为止还没有人观察到碱基编辑器的三维分子结构，”刘如谦教授说，“这个合作项目揭示了一个美丽的分子结构：先进的、高度活跃的碱基编辑器ABE8e在与目标DNA位点接触时被捕获的瞬间。”
“这让我们第一次看到，碱基编辑器以两个独立模块进行工作：Cas9模块提供特异性，还有一个催化模块提供活性。”论文的共同第一作者AudroneLapinaite博士描述道。
结构学数据与酶活检测揭示了ABE8e容易产生脱靶的原因。原来，连接在Cas9上的脱氨酶始终处于激活状态。Cas9在细胞中找到预定目标之前，会不断结合并释放成百数千个DNA片段。换言之，始终处于激活状态的脱氨酶让Cas9变成一门容易走火的大炮，不等Cas9完全匹配到目标，就直接开炮。
这一结果为科学家们重新设计与碱基编辑器带来了新的洞见。“如果想设计真正的特异性融合蛋白，必须找到一种方法使其催化结构域完全成为Cas9的一部分，这样才不会一直处于活跃状态，而是只有在Cas9正确结合到目标后才被激活。”Lapinaite博士说。
此外，ABE8e的结构数据还阐明了新版本碱基编辑器速度更快的秘诀。研究人员发现，相比早期版本，新版本上有两个点突变，可以使蛋白质更紧密地抓住DNA，从而更有效地把A替换为G。
“这种结构和相应的生物化学让人兴奋。我们现在可以对这个系统在细胞中的表现作出理性的预测。”Knott博士补充道。
研究人员指出，这项新研究展示了Cas9融合蛋白的首个结构，因此其结果将为众多从Cas9衍生的基因编辑工具提供设计指导，有助于带来更方便、更可控、更有临床应用价值的基因编辑工具。我们期待进一步改良的碱基编辑系统，可以在不远的将来为遗传病患者带来治疗希望。
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